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常見醫學樣品RNA提取制備方法

百邁客基因2020-02-13 11:40:10

核酸(nucleic acid)在生物界中堪稱主宰,是一類非常重要的生物大分子,它在生物的繁衍、發育、維持、衰老和死亡等一切生命活動中扮演著重要的角色,如果其結構出現稍許的變動,比如一個堿基的差錯、缺失或增加,就有可能導致突變、缺陷或疾病的出現,所以核酸已成為生物化學、遺傳學以及其他有關生命學科的熱門研究課題,其覆蓋面之廣、進展之速為其他學科所望塵莫及。而進行核酸研究的第一個前提就是能夠將核酸從眾多紛繁復雜的生物大分子中提取出來,并純化到一定程度,以便進行相應的科學研究和實際應用。


核酸,快到“管”里來共分六期,通過此系列與大家分享核酸提取樣品制備、提取方法及檢測方面的知識,以期能夠對大家的科研有所幫助。



1

全血樣品


01


?采血管選擇?


采集血液進行檢測面臨的一個主要問題就是細胞內RNA的不穩定性,RNA在采血后數小時內便會迅速降解。此外,某些種屬的RNA在采血后會通過基因誘導在體外增加。體外RNA降解和基因誘導均可導致體內相關基因的轉錄本數目低估或高估。


BD公司的PAXgene血液RNA管內含能夠穩定體內基因轉錄性狀的添加劑,它能夠減少體外RNA的降解,并將基因誘導的水平降低到最小程度,適用于人和靈長類動物全血樣品制備,對于全血樣品,我們只推薦使用此管送樣。


BD PAXgene血液RNA管(貨號762165)


02


?采集血液?


使用PAXgene血液RNA管前請仔細閱讀產品說明書,以便進行正確的操作。如果PAXgene血液RNA管為唯一的抽血管,則將血液抽入PAXgene血液RNA管之前應先抽血入“廢棄管”內,使抽血過程中所用的采血器內能被血液預灌注;否則PAXgene血液RNA管應為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再從持針器上取下試管(PAXgene血液RNA管內的負壓設計可向管內抽2.5ml的血)。



采血后應立即將PAXgene血液RNA管輕輕地顛倒8-10次,以確保管內保護劑和血液充分混合均勻。



03


?保存、運輸?


將PAXgene血液RNA管豎直置于室溫(18-25℃)靜置2-24小時,之后可貯藏于-20℃或更低溫度;若試管要貯藏于低于-20℃的溫度,先在-20℃冷凍24小時,然后再將其轉移到-70℃或-80℃,可保存至少50個月。大體積干冰運輸。



2

血清血漿樣品


由于細胞內含有的RNA的豐度遠高于血液中游離的RNA,即使極少量細胞的存在也會對血液中游離RNA的分析造成很大影響。故去除細胞和細胞碎片的污染是血清血漿樣品制備過程的關鍵。



01

?采血管選擇?


對于血清樣品,使用普通血清真空采血管即可;對于血漿樣品,推薦使用EDTA抗凝管,禁止使用肝素類抗凝管。



02


?血漿樣品的分離、保存?


使用EDTA抗凝管采集血液樣品(采集后的血液樣品可置于室溫或4℃短暫保存,但不得超過1h)。1900g(或3000rpm),4℃,離心10min。小心轉移上層血漿(黃色)至新的1.5ml離心管中,槍頭不要觸碰中間層(白細胞和血小板層)。一般情況下,10ml的血液可分離出4-5ml血漿。將分離出的血漿16000g,4℃,離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側的雜質,小心轉移上清到一個新的1.5ml離心管中,-80℃保存。大體積干冰運輸。


血漿樣品分離


03


?血清樣品的分離、保存?


使用含凝血激活劑的采血管或普通真空采血管采集血液樣品,室溫靜置10-60min使血液凝集。1900g(或3000rpm),4℃,離心10min。小心轉移上層血清(黃色)至新的1.5ml離心管中,槍頭不要觸碰中間層(白細胞和血小板層)。一般情況下,10ml的血液可分離出3-5ml血清。將分離出的血清16000g,4℃,離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側的雜質,小心轉移上清到一個新的1.5ml離心管中,-80℃保存。大體積干冰運輸。


血清樣品分離


3

細胞上清


使用合適的容器收集細胞培養液或其他生物液體。3000g,4℃,離心15min。小心轉移上清液至新的無菌離心管中。將分離出的細胞上清液16000g,4℃,離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側的雜質,小心轉移上清到新的無菌離心管中,-80℃保存。大體積干冰運輸。


細胞上清分離


4

外泌體樣品


對于老師自己富集好的外泌體,需要將外泌體溶解在不大于100ul RNase-free的PBS中并充分混勻,以方便后面提取。外泌體樣品溶液置于-80℃保存。大體積干冰運輸。



5

組織樣


用于提取RNA的醫口組織樣,如果樣品量較小,建議優先選擇保護液(RNAlater等)送樣方式。


 方案一、保護液送樣(RNAlater等) 

用解剖刀將新鮮組織切成長寬高均≤0.5 cm的樣本,小器官如鼠肝、腎和脾可以完整的保存在RNAlater中。將組織樣本浸入5-10倍體積的 RNAlater中,以使組織完全浸沒。將樣本置于4℃孵育過夜(以使 RNAlater 完全滲透組織),然后轉移至-80 ℃長期保存。大體積干冰運輸。


? ? 方案二、液氮速凍送樣 ??

取下新鮮組織,立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型,如果組織體積較大,應盡量將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊(即黃豆大?。?。迅速用預冷的PBS溶液(RNase free)或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈。將處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的液氮預冷凍存管中。迅速置于液氮中冷凍約3h,然后轉移至-80 ℃長期保存。大體積干冰運輸。


注意事項:

1.對于RNA類項目的癌癥樣品,我們建議手術取下的組織迅速放入RNAlater中,4℃孵育24小時,然后棄掉RNAlater,切下壞死區的組織以及癌旁組織,轉入旋蓋的液氮預冷凍存管中,液氮速凍,-80℃保存,干冰運輸。


2.組織樣品離開活體后,建議在3min內進行液氮速凍,速凍前操作時間越長,RNA降解的可能性越大。


3.組織樣不建議使用TRIzol送樣,如必須,需充分液氮研磨后溶于適量TRIzol中,組織樣品切勿過量,常溫裂解5min后,-80低溫凍存,干冰運輸。


6

細胞樣品


一次RNA提取反應所需細胞數≤1×10^7個,以3×10^6—1×10^7個為宜。樣品量較大的話,建議按上述要求將細胞樣品分裝至不同的管中。


01

?貼壁細胞?


從培養箱中取出貼壁培養的細胞,顯微鏡下觀察細胞,確定生長狀態良好(正常細胞融合度在80 %左右)。棄去培養基,向細胞培養瓶或培養皿中加入5mL PBS(RNase-free,室溫)洗一次。棄盡PBS,加入適量TRIzol,反復吸打數次;直至看不見成團的細胞塊,使之充分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液體。將裂解好的細胞溶液轉移至 1.5 mL 旋蓋離心管( RNase-free )中,置于-80 ℃長期保存,大體積干冰運輸。


02

?懸浮細胞?


首先要確定細胞生長狀態良好;離心得到細胞沉淀(依據客戶實驗室細胞離心步驟,注意細胞離心要適度,不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透)。棄去培養基,加入 1 mL PBS(RNase free,室溫),輕輕將細胞沉淀懸起, 轉移至2 mL 旋蓋尖底離心管(RNase free)中。離心(依據客戶實驗室細胞離心步驟,注意細胞離心要適度,不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透)得到細胞沉淀,棄去PBS,加入適量TRIzol中,反復吸打數次,直至看不見成團的細胞塊,使之充分溶解于裂解液中。置于-80 ℃長期保存,大體積干冰運輸。


注意事項:

1.如果是DNA項目普通滅菌PBS清洗即可,如果是RNA項目必須是RNAse-free的。

2.獲取細胞不建議用胰蛋白酶處理,胰酶為蛋白,如果有殘留的話會影響后續實驗。

3.細胞數量低于5×105建議速凍直接送樣(不用裂解液裂解),由于細胞數少,我們會安排微量提取。

4.細胞類樣品不建議保存于RNAlater類組織RNA保護液中送樣,因為RNAlater密度大,保存于其中的細胞難于再離心收集用于提取。


本篇完結,有才的小編突發奇想,愿以本篇軟文的角度賦詩一首,送給有緣的你:



你看,或者不看我

我就在這里

不來不去

你懂,或者不懂我

我就在這里

不悲不喜

我愿意住進你的心里

默然,相助

悄然,歡喜

愿你科研順利


分子實驗中心? ? 畢經德? | ?文案

吳爽? | ?審核

圖片來自網絡,侵刪


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