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應用于代謝組學研究的血液樣本處理與預處理相關綜述(全文)

eBiobank2020-02-19 11:24:59

生物樣本庫BSS小組


摘要:代謝組學已被廣泛應用于臨床研究,并為提高臨床診斷、早期疾病監測、治療預測和治療有效率監測開創了一個新的時代。代謝組學的一個重大挑戰(尤其是那些無針對性的研究)是生物標本極為復雜的多樣性。盡管近年在生物樣本研究領域取得了很大的進展,但仍然存在著基本的需求——即需要注重分析前變量因素。不注重的話很可能導致對后續分析過程的偏差,降低結果的可靠性,并且混淆最終的研究結果。許多研究人員在biomarker發現過程中通常主要關注儀器方面的影響,而樣本相關的變量常被忽略。為了減少差異,在實驗設計和樣品處理及預處理中的一些關鍵信息和標準操作規程(SOPs)是十分必要的。了解不同樣本采集方法之間的變異特性也很必要的,可防止對結果的曲解,并確保觀察到的差異不是由于樣品處理中的不一致引起的實驗偏差。本文對基于血液樣本的影響代謝組學研究的分析前變量進行了系統討論。此外,我們還提供了一套關于實驗設計、樣本采集、預處理程序和存儲條件的建議案作為實踐型綜述,可以指導和服務于SOPs并減少不符合需要的偏差。關鍵詞:干血斑(DBS);實驗變異;無針對性代謝組學;表型分析;血漿和血清采集;標準操作規程(SOPs)


1. 前言

代謝組學分析已經成為人類健康、疾病、臨床生物標志物和藥物研發的重要且必不可少的研究工具,通過對生物系統中所有代謝物的綜合分析,為人類表型提供一種直接標簽特征和敏感的檢測方法。這種方法有助于篩查和早期發現任何與健康和疾病起源有關的代謝障礙。然而,在制定代謝組學的研究計劃時,必須考慮到一些問題挑戰。這些問題非常重要,并與選擇的實驗策略、樣品處理和樣品預處理方法有關。在此過程中,實驗設計必須應用于整個代謝組學工作流程,從明確研究目的、取樣程序、代謝產物提取方法和分析平臺的類型,到最終的數據處理和生物學解釋,都要使用相應的標準操作規程(SOPs)。因此,良好的實驗設計提供了一個以公正的方式來處理和比較樣本的機會。

樣本本身的選擇是一個最基本的重要考慮,它應該直接基于研究目的。本綜述將重點放在血液提取樣本、血清、血漿和干血斑上,關注其在代謝組學biomarker發現中的應用。這些生物樣本在臨床實踐中具有許多優勢,很容易獲得并且取樣時對患者的創傷也最小。雖然在血清或血漿制備過程中,整個血液都是常規處理,但臨床實踐中使用的操作流程有時并不適合biomarker發現項目。因為這些樣本幾乎都經歷了不同的分析前處理過程,這對于來自不同的生物樣本庫或者多中心的生物樣本庫存儲的體液尤其值得注意。即使在靜脈針刺抽血操作、血液抽出到血漿分裝的時間、存儲時間、及存儲條件等方面的輕微差異,都能顯著地影響代謝物的穩定性,因此應該認真地評估。這些因素會嚴重影響分析結果,降低研究的可信度,這也是為什么許多不同來源樣本的驗證研究失敗的原因之一。因此,制定專門適用于下游代謝組學研究的樣本采集處理的操作規程是很重要的。我們將嚴重影響代謝組學分析結果的不理想的實驗差異因素匯總在表1中。樣本采集、預處理、存儲條件和穩定性因素等重要方面導致最終結果偏差也予以討論,以確保從血漿、血清和干血斑樣本中獲得可靠的數據 (1,12)。


2. 影響血樣本檢測結果的分析前因素

2.1 血清和血漿的選擇

血清和血漿廣泛應用于代謝組學研究,但關于哪種樣本更適合于代謝組學研究仍存在爭論。血漿是從全血中通過加入抗凝劑和離心分離得到的,而血清是不加抗凝劑通過凝血和離心除去血細胞和纖維蛋白原后分離得到的上清。然而在一些臨床上特殊的化學檢測和質譜分析時,離心管壁的高分子鍍膜可能會產生一定的影響。因此,對于血清收集,建議使用塑料或最好是玻璃的無添加劑收集管。血漿比血清的優點是快速處理,因為不需要等待血液凝結。凝血時間(30-60分鐘)以及操作過程中的室溫會額外引入變量,更重要的是,這些已被證明影響血清代謝物組分分析,如凝集時間可能會增加某些酶和代謝物的降解,促進代謝物損失;而活化的血小板也會在凝集過程中釋放某些化合物如多肽、次黃嘌呤、黃嘌呤和磷酸鞘氨醇等到血清中。因此,如果選擇血清進行檢測,一定要嚴格遵循SOP,需要特別注意在同一項研究中要統一所有樣本的凝血時間,以評估觀察到的代謝物變化并非來源于活化的血小板。相比而言,血漿因為沒有血液凝集過程而更適宜進行代謝物分析,結果也更容易重復驗證。

血清和血漿采集方法已根據微粒計數、DNA、血紅蛋白濃度、代謝組學和蛋白質組學研究的接受標準進行了驗證。離心溫度和減速過程的可重復性也已進行了評價??偟膩碚f,還沒有哪一個強大的protocol能滿足4度和室溫的要求,提示在樣本預處理過程中系統地應用相同的溫度是很重要的。樣本在室溫下離心可使血清中的微粒產量增加,血漿中溶血性微粒減少,推薦室溫下2000g離心10分鐘(血清)20分鐘(血漿),最近也有4度離心法,總之仍缺乏統一標準。單位體積全血內分離出的血漿更多,不含血小板和凝結后蛋白片段,然而分離血清中的總蛋白含量較低。這可能對小分子分析有更多的好處,特別是過量的蛋白質會導致競爭電離和降低靈敏度。與血清相比,血漿樣品中代謝物濃度的重現性稍好,這可能是由于收集樣品所需的不同程序所致,尤其是減少了凝血環節。

重要的是,對于代謝組學研究,強烈建議在同一項研究中使用的樣本類型和采集方法保持一致性。這有助于控制系統偏差,保證代謝組學分析的質量。盡管血漿有更好的重復性,抗凝血所引起的基質效應也要考慮在內,而具有較高整體敏感性的血清可能是生物標志物研究的一個很好的選擇。

2.2 抗凝藥物的選擇

抗凝劑的選擇是另一個需要考慮的重要因素,因為它可以引入分析偏倚并影響所觀察到的代謝譜的質量。肝素鈉或肝素鋰、枸櫞酸鈉或EDTA鹽等抗凝劑的存在阻止了纖維蛋白原啟動的凝血級聯反應,血液不凝集從而形成血漿。肝素是一個抗凝血酶激活劑,而EDTA和檸檬酸鹽螯合血液中的鈣離子。此外,EDTA不僅抑制血液凝固,也抑制紅細胞中依賴Mg2+的酶,使血漿更適合做下游的代謝組學分析。應該注意的是,EDTA和肝素是以固體形式在血液收集管,而枸櫞酸鈉是液體,通常真空采血管中預配制3.8%枸櫞酸鈉水溶液,要注意選擇合適大小的管子,否則枸櫞酸鈉抗凝劑與血液比例達不到1:9,最終的枸櫞酸鹽濃度也會有變化。全血中枸櫞酸鈉濃度比減少會顯著影響血小板功能的評估,并會增加變異。此外,枸櫞酸鈉的離子強度和pH值可能不適合經典的脂質萃取或LC-MS分析,而且枸櫞酸不能作為代謝物測定。另一方面,作為一種高分子氨基多糖,肝素在MS光譜分析中容易出現典型的重復性空心多聚體。它在LC-MS中的應用有待商榷。

有研究顯示三種常見抗凝劑(肝素鋰,枸櫞酸鈉,EDTA二鉀)和LC-MS分析中代謝產物的結果之間只有微小差異。其他研究還發現EDTA和肝素抗凝血劑的血漿,具有類似的代謝特征??傊?,代謝組學應用抗凝劑的選擇仍然是討論的焦點主題,缺乏明確的建議。一旦我們全面考慮了與使用的特定抗凝劑相關的各種局限性,并且其基本適用于整個研究,那么就應該接受所選擇的策略。

2.3?溶血的影響

溶血表現為細胞膜受損后血紅蛋白和其他細胞成分包括代謝產物(結構蛋白、脂類、碳水化合物)以及酶的釋放。采血過程中小心操作可避免溶血風險。游離血紅蛋白的上限參考值分別為血漿20 mg/L 和血清 50 mg/L。溶血定義為游離血紅蛋白濃度在300 mg/L18.8mmol/L),可看到血清或血漿呈現粉紅色至紅色。然而,在輕微溶血的樣本中,這種顏色變化并不明顯,尤其是當病人的膽紅素水平也增加時。因此,最可靠的檢測輕微溶血的方法是測定樣品中游離血紅蛋白。溶血是最常見的分析前誤差,可明顯改變血液中的代謝物水平。溶血造成的干擾與樣本中的游離血紅蛋白濃度近似線性,直接或間接干擾多種檢測,包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酐(Cr)、肌酸激酶(CK)、鐵、乳酸脫氫酶(LDH)、脂肪酶、鎂、磷、鉀、尿素、白蛋白、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)、葡萄糖和鈉。研究顯示,溶血和清亮血清相比,可引起至少43種代謝物水平明顯改變。其中苯丙氨酸、鳥氨酸、乙酸、檸檬酸、甲酸和琥珀酸等在溶血樣本中升高,而磷脂酰膽堿和鞘脂等脂類的濃度在溶血樣本中下降。不同的實驗設計和對溶血標準的定義和檢測方法的差別影響實驗結果。因此,在評估潛在分析前變量的研究中,建議用分光光度法和溶血指數測定樣本中的溶血水平。強調在無針對性的代謝組學研究中要避免樣本溶血。

2.4存儲條件

通常-80℃凍存是優先推薦的樣本存儲方案。如果臨床條件有限,也可以暫時先存放在-20℃,再轉移到-80℃長期凍存。但是血漿在-20℃超過1個月會造成葡萄糖和脯氨酸等代謝產物的顯著變化。在低溫長期存儲和反復凍融對整個代謝組穩定性的影響仍然是個懸而未決的問題。盡管近年多項研究顯示,-80℃凍存4年以上或反復凍融3次對代謝組的完整性沒有明顯差異,脂類成分變化也很小,還是建議同一項研究中對所有研究分組樣本都最好盡量避免反復凍融,將樣本盡快凍存在低溫-80℃。


3. 樣本質量的指標

分離細胞后代謝物的穩定性仍能被血清和血漿殘留的酶或者許多其它蛋白所影響。因此,樣本處理是嚴重影響代謝組穩定性的重要預處理因素。最近,許多研究觀察了一些與樣品預處理、儲存和代謝水平隨時間變化的樣品處理條件。有研究報道相當數量的代謝物嚴重受到血清血漿處理過程中的分析前變量影響。血液處理的時間、血液凝固后到離心的時間、凍融樣本后到分析檢測之前的時間,都越短越好。另外,吸取血漿時,要小心避免碰觸到白膜層,以免吸到血細胞,從而改變血漿代謝組。對分析前變量敏感的代謝物,包括血清素、次黃嘌呤、?;撬?、谷氨酰胺和谷氨酸、葡萄糖、乳酸、含硫氨基酸、蘇糖酸、麥芽糖、S1P膽固醇代謝物、甘油三酯(TG)、PCS、LPCS和兒茶酚胺類、類花生酸類物質等都具有高度可變性,因此,這些化合物在被認為是候選的biomarker之前應該認真評估。對兒茶酚胺類、類花生酸類物質進行可重復、可靠的分析前,樣品預處理是關鍵的一步,應盡快在受控的溫度下進行。改變血小板代謝和誘導血小板活化的血液處理步驟對于重復分析特定存在于血小板中的5-羥色胺至關重要。但是,必須強調的是,對預分析條件敏感的代謝物必須徹底驗證其可靠性,并對結果進行仔細的解釋。保持4°C低溫下快速處理有助于樣本有效保存。應該強調的是,對分析前條件敏感的代謝物必須經過全面徹底的實驗驗證,以保證其穩健性,結果也要經過仔細的解釋。


4. 干血斑樣本

早在20世紀60年代,干血斑就已用于臨床分析,近年這種樣本類型越來越受到關注。與靜脈采血不同的是,干血斑樣本不需要侵入,不需要從采集器進行多余操作,而且同樣量的血液采集后只有十分之一大小。干血斑樣本采集時不超過75μL,可重復4-6次,靜脈采血則需要5-10mL。此外,對那些血液收集可能有困難的患者如嬰兒、兒童和老人來說,這種侵入性較低的樣本采集尤其具有吸引力。便于采集和運輸也是這種樣本的優點,而且不需要特殊的離心和低溫過程,與血液樣本相比,所需的總空間要小得多。在法醫毒理學、藥物開發臨床實驗、環境污染等方面有極好的應用。由于主要應用關注的是有針對性的分析,其他如紅細胞壓積、紙張規格和斑點均一性等影響因素已被證實可改變定量結果,因此,DBS取樣已成為相關研究的瓶頸之一。

在美國的新生兒篩查中,DBS收集程序遵循疾病控制和預防中心制定的指導方針。為了避免樣品間的差異變化和代謝物降解,紙張規格、采集溫度和收集前清洗過程等都要規范化。一般用純棉纖維紙,因血清吸收量、100微升液滴的直徑和血液吸收時間而不同。穿刺部位需要預溫,可以稍加按摩以促進局部血液流動,70%酒精消毒而后空氣中干燥。不到1歲兒童的穿刺必須在腳后跟外側或內側外邊緣,或者在非習慣用手的中指或無名指指尖。第一滴血放棄不要,通過血滴接觸紙面收集樣本,避免與手直接接觸。對于有效的DBS,只能收集一滴,完全填滿標記區域,然后讓血液在水平位置至少3小時空氣干燥。存儲和運輸條件建議使用空氣流通的包裝,因為密閉包裝會導致溫度和濕度升高,加速降解。DBS樣品必須保持室溫檢測,樣本在48℃短期存儲不超過2年,長期存儲應置于-20℃至-70℃。

在代謝組學研究中,每一個階段都必須仔細考慮,因為不同取樣方法可以給最終結果帶來許多偏差。紙的材質是首要因素,要根據紙的厚度、纖維材質和血液擴散的時間慎重選擇?;瘜W處理過的紙,其中添加劑的應用將導致細胞溶解、病原體滅活、酶和蛋白質變性,也可以用來進行研究。對于無目標的代謝組學研究要優選未處理的紙,因為已處理的卡片上的化學物質會產生更多干擾,并引起離子抑制效應。采集后干燥環節條件也很重要。斑點的面積在40-85%的濕度范圍不受影響。溫度的控制也很重要,一般建議在20℃左右通風環境下進行。最后,空氣中的氧濃度也要注意,由于這不是一個容易控制的因素,必須注意每一個選定的biomarker對空氣氧化的易感性和干燥階段的降解程度進行量化是需要滿足的。

干燥后,必須提供最佳的通風儲存條件,因為潮濕會加速代謝物降解。樣本不要接觸存儲包裝袋的外側,如果DBS收集卡上沒有保護層,則一定要避免不同樣品之間的接觸,以盡量減少交叉污染的風險。貯存后,樣本隨著時間推移的穩定性是另一個重要問題。室溫并不是最理想的儲存溫度,代謝物容易降解。-20℃和-80℃存儲沒有明顯差異,但是即使在更低溫度下,谷氨酰胺還是容易降解。根據目前的研究報道,還是傾向于-80℃存儲更穩定,畢竟沒有明確報道該溫度下有很多代謝物的降解。


5. 小結

血清和血漿通常用來進行代謝組學分析。生物樣本都是動態平衡的過程,其成分在體外也逐步發生變化。許多成分不穩定,容易發生氧化、聚合或降解。不重視分析前過程,可能是結果不具有重復性的主要原因,甚至可能發生假性結果。為了減少代謝組研究中的系統偏差,確定和了解那些所有可能的不期望和不受控制的分析前變量非常重要。然而,采用何種方法進行標準化收集血清、血漿或DBS樣品進行無針對性代謝組學研究,到目前為止還沒有達成共識。樣本預處理過程不一致可能是導致結果沖突的主要原因。因此,任何基于代謝組學的研究都必須詳細記錄樣品采集和樣品處理過程,相關SOP也必須制定和實施。這一策略對于控制和減少實驗變異至關重要,以保證代謝組學結果的最高質量和可靠性。對血液衍生樣品預處理方法和參數優化的進一步驗證將確保樣品穩定性,并將在分析前質量保證中發揮重要作用。最佳實踐和SOPs應該是任何的多中心臨床研究或生物樣本庫存儲過程的一部分,確保后續代謝組學研究結果有效、可靠且具有可比性。另一方面,由于醫院和醫療中心通常負責樣品采集,所以管理這么多問題是不可能實現的。無論如何,實驗人員必須注意以上提及的幾個方面,對所有檢測樣本和對照樣本收集盡可能全的信息,包括采集過程、存儲以及臨床病例信息,這對于解釋非預期或非常規出現的結果是非常有用的。最后必須強調一點,無針對性代謝組學研究可以采用干血斑樣本進行,但是即使遵循上述所有的指南,也必須對結果進行詳細解釋,推薦使用二次檢測來檢查以前提到的問題的影響,如紅細胞壓積和降解效果。

Table 1.Sample variables and pre-analytical factors affecting the outcome of metabolomics studies.

Table2. General remarks for blood sample handling and pre-processing for metabolomics studies.

Table3.Differences in composition between plasma and serum.


作者:Hernandes VV, et al.【San Pablo CEU University, Spain】

編譯:白冰珂【中國人民解放軍第三0二醫院】

校審:劉 妍 ??【中國人民解放軍第三0二醫院】

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原文:【17090】

A review of blood sample handling and pre-processing for metabolomics studies.

Electrophoresis. 2017 May 19. doi:10.1002/elps.201700086.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28543881

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