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有人@你|高通量測序DNA樣品制備寶典來啦!

GENEWIZ金唯智2020-02-07 11:43:10

高通量測序樣品準備工作非常重要,若樣品遭到破壞,就很難得到完美的測序結果。

針對大家都關心的一些問題,如取樣、制備及送樣要求等,小編進行了匯總整理,快來看一下吧!

1樣品制備

動物組織

對于哺乳動物樣品,優先選取肌肉或者嬌嫩的內臟器官如脾臟、肝臟和大腦,活體解剖取樣后,剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織,并將組織分割成50mg左右的小塊(組織塊越小,保存效果越好),分裝到凍存管中。

如果組織塊表面血液過多,可使用0.9%的生理鹽水或PBS緩沖液迅速沖洗,去除血漬和污物。將分裝好的樣品迅速投入液氮中速凍,置于-80℃冰箱中保存,干冰運輸。如果需要胰腺、胃等含有消化液的組織,需盡可能更快的處理好組織,原因在于這類組織由于消化液的存在,降解異常迅速。

昆蟲樣品可能會有污染,建議進行饑餓處理或者喂食抗生素。

若在野外取樣,需將樣品置于盛有約100mL 95%乙醇溶液或含50mmol/L EDTA的70%乙醇溶液的小口塑料瓶中固定保存,24小時換固定劑一次。

不同物種不同組織器官DNA得率會存在一定差別,代謝旺盛的肝臟組織DNA含量較高,脂肪組織不易提取,得率較低。

植物組織


提取植物組織DNA,盡量選用新鮮樣品,其次才是凍存的樣品,反復凍融的樣品DNA很容易受到破壞,不建議使用。樣品采集時需選取幼嫩的組織部位,相對于其他組織,葉片DNA更易提取,建議優先選取葉片組織。

取樣時事先準備好錫箔或鋁箔紙,并用油性記號筆標記好樣本信息。由于植物表面可能會有細菌或者真菌污染,在采集時可用清水沖洗干凈,并用吸水紙吸干樣品表面液體。

取得所需樣品后,立即用準備好的錫箔紙包裹組織,并迅速投入液氮中速凍,-80°C保存,使用干冰運輸。

血液樣品

對于哺乳動物及人的血液樣品,一般選取全血,加入抗凝劑,輕柔顛倒混勻后保存,推薦使用ACD抗凝劑或EDTA抗凝管抽取新鮮血液,由于肝素抗凝會影響實驗結果,不建議使用。一般來說,1mL血液可提取3~5μg的DNA。

若血液樣品不能立即寄送,要置于-80℃儲存,使用干冰運輸(在一周內寄送,可于-20℃運輸)。若儲存時間過長或有溶血、凝血的血液樣品不能使用,建議重新制備樣品。

2送樣標準

對于送樣量,要滿足以下要求。

對于核酸樣品,還需要注意以下幾個方面:

二代測序(常規小片段文庫)

核酸質量≥300ng, OD260/280比值在1.8-2.2之間, 濃度≥10ng/μL, 體積≥10μL。瓊脂糖凝膠電泳DNA 條帶清晰無降解,無RNA 和蛋白污染。

三代測序(20K文庫)

核酸質量≥20μg;濃度≥100ng/μL ,OD260/280比值1.8-2.0,OD260/230比值2.0-2.2。 Nanodrop濃度與 Qubit濃度比值≤2;樣品澄清無色,無不溶解物;脈沖電泳DNA條帶清晰無降解,無RNA和蛋白污染。

3樣品包裝運輸注意事項

1.不要用紗布(樣本易粘附在紗布上)、紙張(低溫凍存易碎)直接包裹樣本,而是用鋁箔或進口凍存管包裝。

2. 在包裹樣本的鋁箔或進口凍存管表面,用油性記號筆標明樣本編號等信息,并且不要與乙醇等有機溶劑接觸。

3.不要用玻璃容器或密封性不好的容器在液氮中保存樣本(玻璃器皿或密封性不好的容器從液氮中取出后會發生爆炸);樣本包裝中不要使用透明膠帶(膠帶在低溫條件下粘性減弱,易掉落)。

4.不要把標簽紙或其他紙制的說明性文件放入樣本袋內,因為紙張在液氮中易碎。

5.不要在一只樣本袋中放過多的樣本,以防無法放入液氮罐或無法從液氮罐中取出。

6.客戶在填寫《樣本信息單》時應當詳細描述樣本的類型、處理方法、儲存條件、儲存時間以及需要進行的檢測類型等相關細節,以便技術人員確定合理的樣本抽提或處理方案。

7.干冰使用量:24小時到達的,干冰數量不得低于5公斤;大于24小時到達的,建議保證每天3公斤的干冰數量。夏季可以適當再多增加部分干冰(平時的 1.5 倍)。

關于高通量測序DNA樣品制備,就說到這里啦~

如果您還有其他疑問,可以發送郵件至[email protected],或撥打電話400-8100-669 選項3進行咨詢,2018我們繼續同行。

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