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運輸小鼠冷凍精子的新介質

中國實驗動物信息網2020-02-29 09:38:36

運輸小鼠遺傳物質較活體運輸有倫理優勢且更加便利,保障動物福利的同時也避免活體動物運輸相關的復雜的法規。目前運輸小鼠遺傳物質多選擇在-196℃液氮中。由于冷凍保存和復蘇技術的創新,精子冷凍正在成為一種更為方便的選擇。此外,冷凍的精子對冷凍后溫度的波動也較不敏感。

這篇文章證明冷凍精子可以安全的在干冰(-79℃)中儲存至少七天,實驗已經得到多個實驗室的驗證。另外,精子在干冰運輸后可以返回液氮中長期儲存,沒有明顯的影響。

實驗1:六個品系小鼠精子的短暫儲存(-80℃?7天)

C57BL/6J,C57BL/6N,FVB/NJ,BALB/c,129/SvJ和CD1的野生型精子在-80℃下儲存7天后IVF結果如圖1A,結果顯示,對比在液氮中保存的精子(C組),不論使用哪種冷凍方法(CPM,gCPA或CPA),精子可以在-80℃下儲存至少7天(A組),而不會顯著喪失受精能力。

圖1

此外,結果表明,在-80℃儲存至少7天的精子可以返回到液氮中儲存(B組),而不會顯著損失受精力。統計分析表明,只有“冷凍方法”和“品系背景”對IVF有顯著性影響,而保存介質、保存溫度無明顯影響。另一方面,已經知道受精率是取決于所使用的小鼠品系的遺傳背景。例如,129/SvJ精子用CPA方法受精率最低(10%±1%介于A組和C組之間)而C57BL/6N精子(A,B和C組)不管使用哪種冷凍方法受精率總是為60%。這些結果還證實CPA法是所有測試中精子冷凍/復蘇效率最低的。圖1B表明-80℃和液氮存儲的精子復蘇IVF后胚胎移植獲得的后代在數量上沒有顯著差異。同樣的,從-80℃再返回液氮冷凍的精子與以上兩組也沒顯著差異。所有遺傳背景和冷凍法都是如此。例如,C57BL/6N用gCPA方法冷凍精子獲得的胚胎在所有實驗組中得到了類似的數據:C組為55.40%±1.3%,A組為54.35%±2.5%,B組為55.90%±1.8%。

胚胎移植后的生仔率范圍從最小值26.96%(CPA法精子冷凍近交系129/SvJ)到最大值72.20%(gCPA法精子冷凍遠交系CD1),這個結果與平時數據一致。

實驗2:轉基因小鼠精子的短暫儲存(-80℃ 7天)

實驗2與實驗1操作一致,除了精子的品系來源不同。在-80℃中儲存7天后IVF結果(二細胞胚胎/卵母細胞百分比)如圖2所示。結果顯示,不論使用哪種方法(CPM,gCPA或者CPA)冷凍轉基因鼠精子都可以在-80℃儲存至少7天(A組),并且對比C組,再次返回液氮冷凍(B組)沒有明顯損失受精潛力,我們也沒有觀察到樣品儲存與其他因素之間有任何相互作用,如冷凍方法,基因和遺傳背景。

在-80℃下儲存的精子不會影響胚胎的發育和產仔能力,生仔率取決于品系背景,基因和冷凍方法。對于每一次的胚胎移植,三組之間的生仔率沒有明顯的差異,數據見圖2B。

圖2

實驗3:模擬運輸:對比在-80℃超低溫冰箱和干冰中儲存7天的精子

CPM方法冷凍的轉基因小鼠(C57BL/6N和C57BL/6J背景)的精子在超低溫冰箱(-80℃)、干冰(-79℃)中儲存7天,TVF結果如圖3A所示。對于每個遺傳背景,不同組之間沒有顯著差異。結果表明,冷凍精子可以在-80℃超低溫冰箱或在-79℃的干冰中儲存七天,而不會顯著改變受精力。所有實驗組中倆個品系背景有百分之五十或者更多的胚胎移植生仔(圖3B)。再次證實處理本身和品系背景的相互作用對IVF和移植生仔率沒有顯著影響。


圖3

實驗4:運輸轉基因精子

精子樣本(含C57BL/6N 背景的3個轉基因和C57BL/6J背景的3個轉基因)用CPM和gCPA冷凍,使用干冰運輸兩根麥管,圖4A中顯示多個實驗室研究的結果,轉基因的受精率在37.2% (CPM法EM03992基因)到79.4%(CPM法EM02571基因 )之間,每一個實驗室都從IVF中獲得二細胞胚胎。這些胚胎移植進雌鼠體內后,雌鼠有很高的生仔率,如圖4B所示。實驗證明了不論冷凍方法和品系背景,各實驗室之間差異都很小,精子可以在干冰中運輸至少三天而不喪失受精能力。

圖4



本文來源:南京大學-南京生物醫藥研究院




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